蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16助力河南大學(xué)抗體藥物開發(fā)技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室的科研工作者于 2025年3月在《International Journal of Biological Macromolecules》期刊上發(fā)表“Attenuation of cardiac ischemia/reperfusion injury via the decoy receptor DcR2 by targeting the PLAD domain of the death receptor DR5”論文。

本研究旨在確定 DcR2 的作用靶點(diǎn)，并探究 DcR2 在小鼠心肌 I/R 損傷中的心肌保護(hù)機(jī)制。結(jié)果表明，hDcR2-Fc 融合蛋白對心肌缺血/再灌注損傷具有顯著的保護(hù)作用。DcR2 通過其 PLAD 結(jié)構(gòu)域與 DR5 形成異源復(fù)合物，該結(jié)構(gòu)域不具有完整的死亡結(jié)構(gòu)域，因而無法向下游傳遞信號(hào)。此外，復(fù)合物的形成掩蓋了與配體 TRAIL 相互作用的位點(diǎn)，從而減輕了缺血/再灌注損傷后的心肌細(xì)胞死亡。因此，本研究揭示了 DcR2 的 PLAD 結(jié)構(gòu)域在抑制細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，為新型藥物的研發(fā)提供了潛在靶點(diǎn)。

Lijie Zhang, Xinyuan Zhang, Ziting Li, Tingting Mo, Wanting Feng, JingLun Zhang, Dan Zhao, Ying Wang, Yinxiang Wei, Yaohui Wang

Joint National Laboratory for Antibody Drug Engineering, the First Affiliated Hospital, Henan University, Kaifeng, China

School of Medicine, Henan University, Kaifeng, China

Joint National Laboratory for Antibody Drug Engineering, Henan University, Kaifeng, China

Zhou, D. et al.

蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)多肽鏈在溫度影響下的形變能力，主要體現(xiàn)在溫度改變時(shí)多肽鏈的化學(xué)特性和空間構(gòu)象的變化，變化越小熱穩(wěn)定性越高。蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性受到不同溫度、pH值、離子強(qiáng)度等外界因素的影響，在生物技術(shù)、藥物研發(fā)以及食品工業(yè)等領(lǐng)域，具有重要意義。

蛋白質(zhì)變性溫度是生物學(xué)家們研究蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性的一個(gè)重要的概念，是指蛋白質(zhì)在特定溫度條件下受到熱力作用時(shí)，其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的溫度點(diǎn)，一般溫度較高時(shí)，蛋白質(zhì)從穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)變化成松散的無序結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性一般使用熱變性中點(diǎn)溫度（Tm）來表示，即蛋白質(zhì)解折疊50% 時(shí)的溫度。

01 前言

缺血缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞死亡是心肌損傷的主要原因。DcR2 是 TRAIL 的誘騙受體，DcR2 在心肌缺血/再灌注（I/R）損傷中的作用尚不清楚。近期研究表明，DcR2 不僅作為受體與 TRAIL 結(jié)合，還能作為 DR5 的配體在體外阻斷 TRAIL 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但 DcR2 在體內(nèi)對 TRAIL 或 DR5 的親和力偏好尚不清楚。之前的研究發(fā)現(xiàn)，hDcR2-Fc 融合蛋白在小鼠心肌 I/R 損傷模型中發(fā)揮心臟保護(hù)作用，通過減少細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)。親和力測定表明，DcR2 對 DR5 的親和力大于對 TRAIL 的親和力，且 DcR2 更傾向于與 DR5 結(jié)合。機(jī)制研究表明，PLAD 的缺失消除了 hDcR2-Fc 對 I/R 引起的心肌損傷的保護(hù)作用。DcR2 通過類似的 PLAD 結(jié)構(gòu)域與 DR5 形成異源復(fù)合物。綜上所述，本研究揭示了 DcR2 可通過 PLAD 結(jié)構(gòu)域靶向 DR5 形成異源復(fù)合物，阻斷細(xì)胞凋亡，從而改善心肌 I/R 損傷，為心肌 I/R 損傷的治療提供了新的預(yù)防策略。

02 摘要

急性心肌梗死（AMI）是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病，全球范圍內(nèi) AMI 的死亡率仍然很高。由缺血缺氧引起的心肌細(xì)胞死亡是一種不可逆的損傷。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）能有效降低急性心肌梗死患者的死亡率，但存在兩大難題，即治療的黃金時(shí)間短以及缺血/再灌注（I/R）損傷。此外，長期心力衰竭的發(fā)生率也很高。為了縮小心肌梗死的范圍，延長心肌細(xì)胞死亡的“窗口期”，改善患者的長期預(yù)后，需要研發(fā)能夠減少或逆轉(zhuǎn)心臟損傷的新療法。

心肌梗死通常伴有多種病理變化，其中最嚴(yán)重的是心肌細(xì)胞凋亡。然而，臨床上尚無治療心肌細(xì)胞凋亡的有效策略。因此，尋找預(yù)防心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵靶點(diǎn)可能為心肌梗死的預(yù)防和治療提供新的策略。腫瘤壞死因子（TNF）相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL），也稱為Apo2配體，屬于TNF配體超家族。迄今為止，人類已鑒定出五種TRAIL受體。DR4（TRAIL-R1）和DR5（TRAIL-R2）被稱為死亡受體（DRs），它們具有完整的死亡結(jié)構(gòu)域（DD），能夠傳遞由TRAIL調(diào)節(jié)的死亡信號(hào)。DRs介導(dǎo)相關(guān)下游信號(hào)通路的激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其中DR5是主要的死亡受體。作者之前的研究證實(shí)sDR5-Fc融合蛋白可以特異性阻斷TRAIL-DR5通路，從而改善猴、豬、大鼠心肌梗死后的心功能。

03 結(jié)果

為了確定 PLAD 是否介導(dǎo) DcR2 與 DR5 的結(jié)合，作者制備了 PLAD 結(jié)構(gòu)域缺失的 DcR2ΔPLAD-Fc 融合蛋白。PLAD 結(jié)構(gòu)域的去除并未影響DcR2 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但其熔解溫度（Tm）略有下降，表明其穩(wěn)定性有所減弱。隨后測定 DcR2APLAD-Fc 與 TRAIL 的親和力為 4.724×10-7 M，略低于野生型。細(xì)胞凋亡阻斷實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，去除 PLAD 結(jié)構(gòu)域后 DcR2 無法阻斷細(xì)胞凋亡，這證實(shí)了 PLAD 結(jié)構(gòu)域的重要性。

作者進(jìn)一步借助蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16，通過差示掃描熒光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）原理進(jìn)行NiV G-ferritin和NiV sG的熱穩(wěn)定性分析，結(jié)果表明，NiV G-ferritin和NiV sG表現(xiàn)出相似的熱穩(wěn)定性，Tm為~65°C，表明NiV G和ferritin的融合對其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性沒有顯著影響。

由于NiV G-ferritin可以誘導(dǎo)強(qiáng)大的體液免疫反應(yīng)，研究者還從NiV G-ferritin免疫小鼠體內(nèi)篩選、制備了一批單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）。在分離的27種mAbs中，25種mAbs可以有效抑制水皰性口炎病毒（VSV）為骨架的NiV假病毒的感染，其抑制50%的NiV假病毒感染所需要的濃度（IC50）低于10 ng/mL。表位競爭分析發(fā)現(xiàn)，篩選得到的27個(gè)mAbs可以識(shí)別NiV G蛋白上4個(gè)不同的抗原表位，包括2個(gè)新的此前未被報(bào)道的表位。最后，研究者在尼帕病毒感染的致死模型（敘利亞金黃倉鼠）上評估了NiV G-ferritin誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)和保護(hù)效果。研究發(fā)現(xiàn)給與倉鼠2針或者3針的NiV G-ferritin后，倉鼠體內(nèi)均產(chǎn)生了高中和活性的血清，且接種2次或者3次均能夠幫助倉鼠100%的抵抗致死劑量NiV的攻擊。研究者進(jìn)一步檢測了3針疫苗接種倉鼠體內(nèi)的病毒RNA含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，倉鼠的肺臟、腦和脾臟中均未檢測到病毒RNA，表明三劑NiV G-ferritin抑制了病毒在倉鼠肺部、大腦和脾臟的復(fù)制。

04 方法

差示掃描熒光法

使用PSA-16儀器（北京佰司特科技有限責(zé)任公司）通過差示掃描熒光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）測定靶蛋白的熱穩(wěn)定性。將樣品稀釋至0.5mg/mL，并將20μL稀釋后的樣品裝入石英玻璃管中。使用23至97°C的線性溫度掃描，以1°C/min的加熱速度實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)測量靶蛋白在280nm紫外激發(fā)下的330nm和350nm的熒光強(qiáng)度（F）。根據(jù)F350nm/F330nm曲線的斜率計(jì)算熱變性中點(diǎn)溫度（thermal transition midpoint，Tm）。每個(gè)樣品平行測量四次。

多角度光耦合的粒徑排除色譜法散射(SEC-MALS)

每個(gè)樣品100 μL體積(NiV g -鐵蛋白0.5mg/mL, 2mg/ mL) mL (NiV sG)注入WTC-030S5色譜柱(Wyatt Technology， Santa Barbara, CA, USA)，等溫運(yùn)行0.5 mL/min 以20mMTris-HClpH8.0和150mmnacl為移動(dòng)端 階段。一個(gè)MALS檢測器(DAWN®)和一個(gè)折射率檢測器(RI) (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA)串聯(lián)到 SEC系統(tǒng)上的紫外線探測器。牛血清白蛋白(BSA 采用Scientific)對靜態(tài)光散射探測器進(jìn)行歸一化處理。光 散射，差折射率(dRI)測量，和分子 采用ASTRA軟件(6.1.2.84)(Wyatt Technology)。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

采用ELISA法檢測NiV g -鐵蛋白的抗原性。簡單地說,96 - 用3 μg/mL的NiV在4℃下包被ELISA板(康寧)過夜 sG或NiV g -鐵蛋白涂層緩沖液(0.1Mcarbonate, pH9.6)。后四個(gè) 用PBS-T(pbs含0.05%Tween 20)沖洗1次后，所有的孔都被堵塞 用50 μL阻斷緩沖液(PBS-T中1% BSA)在37℃下作用2 h。后 阻斷，NiV G單抗HENV-32, HENV-26, nAH1.3，抗狂犬病 病毒單抗RVC20(陰性對照)從5 μg/mL開始依次稀釋 加入板中，37℃孵育2 h PBS-T洗滌4次，然后加入HRP結(jié)合的山羊抗人抗體 IgG(1∶20000稀釋，ab克隆，AS002)在37℃下保存1 h。盤子 用50 μL/孔的單組份TMB顯色劑沖洗染色 溶液(NCMBiotech)在37°C下保存10-30分鐘。底物反應(yīng) 加入50 μL/孔的1M HCl，吸光度為 在450nm處測量(OD450)。對于血清結(jié)合滴度檢測，作者通過 NiV-M、NiV-B、NiV-B的G頭蛋白 將HeV、LayV和MojV包被在ELISA板上，HRP偶聯(lián) 采用山羊抗小鼠IgG(1∶8000稀釋，ab克隆，AS003)。

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05 總結(jié)

綜上，本研究成功設(shè)計(jì)了一種以NiV G蛋白頭部域?yàn)榭乖袠?biāo)，以ferritin為展示平臺(tái)的新型納米顆粒候選疫苗，并分離了一批具有潛在治療效果的單克隆抗體。研究為深入理解尼帕病毒G蛋白的免疫原性提供了新的見解，NiV G-ferritin有望進(jìn)一步開發(fā)為亨尼帕病毒的廣譜候選疫苗，為全球公共衛(wèi)生安全提供新的防護(hù)策略。

武漢大學(xué)病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室趙海艷研究員和中國科學(xué)院武漢病毒研究所鄧增欽研究員為該論文的共同通訊作者。武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士研究生周丹、已畢業(yè)的碩士研究生程嬈以及中國科學(xué)院武漢病毒研究所高級(jí)實(shí)驗(yàn)師姚艷豐博士為論文的共同第一作者。

該研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、湖北省衛(wèi)生健康委青年人才項(xiàng)目和中國科學(xué)院院級(jí)人才項(xiàng)目的資助，并獲得武漢國家生物安全實(shí)驗(yàn)室和武漢病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的支持。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41541-024-00954-5

作者借助北京佰司特科技有限責(zé)任公司自主研發(fā)的蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16，通過差示掃描熒光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）原理進(jìn)行NiV G-ferritin和NiV sG的熱穩(wěn)定性分析，結(jié)果表明，NiV G-ferritin和NiV sG表現(xiàn)出相似的熱穩(wěn)定性，Tm為~65°C，表明NiV G和ferritin的融合對其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性沒有顯著影響。